D-蛋白质合成体抗体设计研究进展

Lylia AZZOUG 论文答辩内容：
D-蛋白质合成体完全由D型氨基酸及无手性的甘氨酸构成，可视为天然蛋白质的“镜像”版本。这类分子凭借其对蛋白酶的高度耐受性以及体内低免疫原性，已成为开发新型治疗工具的重要候选对象。尽管潜力巨大，但由于缺乏高效且通用的发现与制备方法，其应用仍受到限制。本研究探索了一种创新的多学科策略，旨在设计能够同时靶向两种生物靶点——5-HT7受体与LINGO-1蛋白的D型单域重链抗体（D-VHHs）。该策略被称为“镜像免疫策略”（Mirror-Image Immunization Strategy, MIIS）。

其核心机制在于：通过对骆驼科动物免疫一种“镜像”肽段——该肽段本身免疫原性较弱，但通过与强免疫原性的L型蛋白质共价结合形成复合物后，可有效激发免疫反应。为此，我们发展了一种基于富含二硫键肽段的生物偶联方法。该方法通过引入刚性间隔基，使外源引入的硫醇（用于硫醇-马来酰亚胺偶联）远离关键的二硫键区域，从而完整维持抗原的天然二硫键连接构象。

通过MIIS策略，我们成功获得了针对5-HT7受体来源D-肽段的L-VHHs，并采用重组技术进行制备。经等温滴定量热法（ITC）与荧光强度分布分析（FIDA）验证，这些L-VHHs表现出显著的立体特异性结合能力。然而，在尝试全化学合成其中一个VHH的过程中，我们遇到了关键困难：部分必需肽段在天然化学连接（NCL）组装过程中溶解度较低，阻碍了高效合成。

为突破这一限制，我们开发了一种新型临时性溶解辅助基团。该基团由三个预连接在Hmb（2-羟基-4-甲氧基苄基）衍生物上的赖氨酸组成，在NCL反应条件下保持稳定，并可在后续温和条件下高效去除。为验证其效果，我们选取了易于聚集的SUMO-2蛋白C末端区域进行合成测试，结果证明该辅助策略能显著改善肽段溶解性与连接效率。

与此同时，为进一步完善该发现流程，我们基于已获得的VHHs高变区3（CDR3）序列，尝试设计并构建了迷你化的D型配体环结构，以期推动靶向性D型分子工具的开发。